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【央视新闻客户端】

一般使用农杆菌介导转化法 ，即用农杆菌的质粒

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位
，并诱导产生冠瘿瘤或发状根
。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA ，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后
，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系 。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区 ，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合
，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株
。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中 ，近年来
，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。

基因工程是指在基因水平上，按照人类的需要进行设计 ，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系
，并能使之稳定地遗传给后代 。基因工程采用与工程设计十分类似的方法，明显地既具有理学的特点 ，同时也具有工程学的特点。

生物学家在了解遗传密码是RNA转录表达以后，还想从分子的水平去干预生物的遗传
。1973年
，美国斯坦福大学的科恩教授，把两种质粒上不同的抗药基因裁剪下来 ，拼接在同一个质粒中。当这种杂合质粒进入大肠杆菌后
，这种大肠杆菌就能抵抗两种药物，且其后代都具有双重抗菌性 ，科恩的重组实验拉开了基因工程的大幕 。

DNA重组技术是基因工程的核心技术
。重组
，顾名思义，就是重新组合 ，即利用供体生物的遗传物质
，或人工合成的基因，经过体外切割后与适当的载体连接起来 ，形成重组DNA分子
，然后将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。 （1）目的基因

基因工程是一种有预期目的的创造性工作 ，它的原料就是目的基因 。所谓目的基因，是指通过人工方法获得的符合设计者要求的DNA片段
。在适当条件下
，目的基因将会以蛋白质的形式表达，从而实现设计者改造生物性状的目标。

（2）载体

目的基因一般都不能直接进入另一种生物细胞 ，它需要与特定的载体结合,才能安全地进入到受体细胞中 。目前常用的载体有质粒、噬菌体和病毒
。

质粒是在大多数细菌和某些真核生物的细胞中发现的一种环状DNA分子
，它位于细胞质中。许多质粒含有在某种环境下可能是必不可少的基因 。

噬菌体是专门感染细菌的一类病毒，由蛋白质外壳和中心的核酸组成
。在感染细菌时 ，噬菌体把DNA注入到细菌里
，以此DNA为模板，复制DNA分子 ，并合成蛋白质
，最后组装成新的噬菌体。当细菌死亡破裂后，大量的噬菌体被释放出来 ，去感染下一个目标 。

质粒 、噬菌体和病毒的相似之处在于
，它们都能把自己的DNA分子注入到宿主细胞中并保持DNA分子的完整，因而 ，它们成为运载目的基因的合适载体。因此，基因工程中的载体实质上是一些特殊的DNA分子
。

（3）工具酶基因工程需要有一套工具
，以便从生物体中分离目的基因，然后选择适合的载体 ，将目的基因与载体连接起来。DNA分子很小
，其直径只有20埃（10-10米） 。基因工程实际上是一种“超级显微工程”，对DNA的切割
、缝合与转运 ，必须有特殊的工具
。

1968年
，科学家第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶。限制性内切酶最大的特点是专一性强，能够在DNA上识别特定的核苷酸序列 ，并在特定切点上切割DNA分子 。70年代以来
，人们已经分离提取了400多种限制性内切酶
。有了它，人们就可以随心所欲地进行DNA分子长链切割了。表4-3是一些限制性内切酶的识别位点

1976年 ，5个实验室的科学家几乎同时发现并提取出一种酶
，作DNA连接酶 。从此，DNA连接酶就成了 “粘合 ”基因的“分子粘合剂
”
。 一个典型的DNA重组包括五个步骤：

（1）目的基因的获取

目前 ，获取目的基因的方法主要有三种：反向转录法、从细胞基因组直接分离法和人工合成法。

反向转录法是利用mRNA反转录获得目的基因的方法 。现在用这种方法人们已先后合成了家兔 、鸭和人的珠蛋白基因
、羽毛角蛋白基因等
。

从细胞基因组中直接分离目的基因常用鸟枪法，因为这种方法犹如用散弹打鸟,所以又称散弹枪法。用鸟枪法分离目的基因
，具有简单、方便和经济等优点 。许多病毒和原核生物 、一些真核生物的基因，都用这种方法获得了成功的分离。

化学合成目的基因是20世纪70年代以来发展起来的一项新技术
。应用化学合成法 ，可在短时间内合成目的基因。科学家们已相继合成了人的生长激素释放抑制素、胰岛素
、干扰素等蛋白质的编码基因 。

（2）DNA分子的体外重组

体外重组是把载体与目的基因进行连接
。例如
，以质粒作为载体时，首先要选择出合适的限制性内切酶 ，对目的基因和载体进行切割
，再以DNA连接酶使切口两端的脱氧核苷酸连接。于是目的基因被镶嵌进质粒DNA，重组形成了一个新的环状DNA分子（杂种DNA分子） 。

（3）DNA重组体的导入

把目的基因装在载体上后 ，就需要把它引入到受体细胞中
。导入的方式有多种
，主要包括转化、转导 、显微注射
、微粒轰击和电击穿孔等方式。转化和转导主要适用于细菌一类的原核生物细胞和酵母这样的低等真核生物细胞，其他方式主要应用于高等动植物的细胞 。

（4）受体细胞的筛选

由于DNA重组体的转化成功率不是太高 ，因而
，需要在众多的细胞中把成功转入DNA重组体的细胞挑选出来
。应事先找到特定的标志，证明导入是否成功。 例如 ，我们常用抗生素来证明证明导入的成功 。

（5）基因表达

目的基因在成功导入受体细胞后，它所携带的遗传信息必须要通过合成新的蛋白质才能表现出来
，从而改变受体细胞的遗传性状
。目的基因在受体细胞中要表达，需要满足一些条件。例如 ，目的基因是利用受体细胞的核糖体来合成蛋白质
，因此目的基因上必须含有能启动受体细胞核糖体工作的功能片段 。

这五个步骤代表了基因工程的一般操作流程。

人们掌握基因工程技术的时间并不长，但已经获得了许多具有实际应用价值的成果
。基因工程作为现代生物技术的核心 ，将在社会生产和实践中发挥越来越重要的作用。 关于细胞工程的定义和范围还没有一个统一的说法
，一般认为，细胞工程是根据细胞生物学和分子生物学原理 ，采用细胞培养技术
，在细胞水平进行的遗传操作 。细胞工程大体可分染色体工程、细胞质工程和细胞融合工程
。1 、细胞培养技术

细胞培养技术是细胞工程的基础技术。所谓细胞培养，就是将生物有机体的某一部分组织取出一小块 ，进行培养
，使之生长
、分裂的技术 。细胞培养又叫组织培养
。近二十年来细胞生物学的一些重要理论研究的进展，例如细胞全能性的揭示 ，细胞周期及其调控，癌变机理与细胞衰老的研究
，基因表达与调控等，都是与细胞培养技术分不开的。

体外细胞培养中 ，供给离开整体的动植物细胞所需营养的是培养基
，培养基中除了含有丰富的营养物质外，一般还含有刺激细胞生长和发育的一些微量物质 。培养基一般有固态和液态两种 ，它必须经灭菌处理后才可使用
。此外
，温度、光照 、振荡频率等也都是影响培养的重要条件。

植物细胞与组织培养的基本过程包括如下几个步骤：

第一步，从健康植株的特定部位或组织 ，如根
、茎、叶 、花
、果实、花粉等
，选择用于培养的起始材料（外植体） 。

第二步，用一定的化学药剂（最常用的有次氯酸钠 、升汞和酒精等）对外植体表面消毒 ，建立无菌培养体系
。

第三步
，形成愈伤组织和器官，由愈伤组织再分化出芽并可进一步诱导形成小植株。

动物细胞培养有两种方式 。一种叫非贴壁培养：也就是细胞在培养过程中不贴壁 ， 条件较为复杂， 难度也大一些
，但是容易同时获得大量的培养细胞。这种方法一般用于淋巴细胞、肿瘤细胞和一些转化细胞的培养
。另一种培养方式是贴壁培养：也称为细胞贴壁，贴壁后的细胞呈单层生长 ，所以此法又叫单层细胞培养。大多数哺乳动物细胞的培养必须采用这种方法 。

动物细胞不能采用离体培养
，以人的皮肤细胞培养为例，动物细胞培养的主要步骤如下：

第一步 ，在无菌条件下
，从健康动物体内取出适量组织，剪切成小薄片
。

第二步 ，加入适宜浓度的酶与辅助物质进行消化作用使细胞分散。

第三步
，将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以适宜的浓度加在培养基中 ，37℃下培养
，并适时进行传代 。（图4-31）

在细胞培养中，我们经常使用一个词——克隆
。克隆一词是由英文clone音译而来 ，指无性繁殖以及由无性繁殖而得到的细胞群体或生物群体。细胞克隆是指细胞的一个无性繁殖系 。自然界早已存在天然的克隆，例如
，同卵双胞胎实际上就是一种克隆
。

基因工程中，还有称为分子克隆(molecular cloning)的 ，是科恩等在 1973年提出的。分子克隆发生在DNA分子水平上
，是指从一种细胞中把某种基因提取出来作为外源基因，在体外与载体连接 ，再将其引入另一受体细胞自主复制而得到的DNA分子无性系 。

2
、细胞核移植技术

由于克隆是无性繁殖
，所以同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，这样有利于忠实地保持原有品种的优良特性
。人们开始探索用人工的方法来进行高等动物克隆。哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种 。其中 ，细胞核移植是发展较晚但富有潜力的一门新技术。

细胞核移植技术属于细胞质工程
。所谓细胞核移植技术
，是指用机械的办法把一个被称为“供体细胞”的细胞核（含遗传物质）移入另一个除去了细胞核被称为“受体 ”的细胞中，然后这一重组细胞进一步发育、分化。核移植的原理是基于动物细胞的细胞核的全能性 。

采用细胞核移植技术克隆动物的设想 ，最初由一位德国胚胎学家在1938年提出
。从1952年起
，科学家们首先采用两栖类动物开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年 ，我国童第周教授领导的科研组，以金鱼等为材料
，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功 。到1995年为止 ，在主要的哺乳动物中
，胚胎细胞核移植都获得成功，但成体动物已分化细胞的核移植一直未能取得成功
。

1996年 ，英国爱丁堡罗斯林研究所
，伊恩·维尔穆特研究小组成功地利用细胞核移植的方法培养出一只克隆羊——多利，这是世界上首次利用成年哺乳动物的体细胞进行细胞核移植而培养出的克隆动物。图4-33克隆羊示意图 。

在核移植中 ，并不是所有的细胞都可以作为核供体
。作为供体的细胞有两种：一种是胚胎细胞
，一种是某些体细胞。

研究表明，卵细胞 、卵母细胞和受精卵细胞都是合适的受体细胞 。

2000年6月 ，我国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊
”
，这表明我国科学家也掌握了哺乳动物体细胞核移植的尖端技术
。

核移植的研究，不仅在探明动物细胞核的全能性
、细胞核与细胞质关系等重要理论问题方面具有重要的科学价值 ，而且在畜牧业生产中有着非常重要的经济价值和应用前景。

3、细胞融合技术

细胞融合技术属于细胞融合工程 。细胞融合技术是一种新的获得杂交细胞以改变细胞性能的技术，它是指在离体条件下
，利用融合诱导剂，把同种或不同物种的体细胞人为地融合 ，形成杂合细胞的过程。细胞融合术是细胞遗传学 、细胞免疫学
、病毒学、肿瘤学等研究的一种重要手段

动物细胞融合的主要步骤是：

第一步
，获取亲本细胞
。将取样的组织用胰蛋白酶或机械方法分离细胞，分别进行贴壁培养或悬浮培养。

第二步 ，诱导融合 。把两种亲本细胞置于同一培养液中
，进行细胞融合
。动物细胞的融合过程一般是：两个细胞紧密接触→细胞膜合并→细胞间出现通道或细胞桥→细胞桥数增加扩大通道面积→两细胞融合为一体。

植物细胞融合的主要步骤是：

第一步，制备亲本原生质体 。

第二步 ，诱导融合
。

微生物细胞的融合步骤与植物细胞融合基本相同。

从20世纪70年代开始
，已经有许多种细胞融合成功，有植物间 、动物间
、动植物间甚至人体细胞与动植物间的成功融合的新的杂交植物 ，如 “西红柿马铃薯”、“拟南芥油菜 ”和“蘑菇白菜”等 。（图4-36是利用细胞融合培育杂交植物）从目前的技术水平来看
，人们还不能把许多远缘的细胞融合后培养成杂种个体，尤其是动物细胞难度更大
。 现代的发酵工程。又叫微生物工程 ，指采用现代生物工程技术手段，利用微生物的某些特定的功能
，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程 。发酵是微生物特有的作用 ，几千年前就已被人类认识并且用来制造酒 、面包等食品
。20世纪20年代主要是以酒精发酵
、甘油发酵和丙醇发酵等为主。20世纪40年代中期美国抗菌素工业兴起
，大规模生产青霉素以及日本谷氨酸盐(味精)发酵成功，大大推动了发酵工业的发展 。

20世纪70年代 ，基因重组技术、细胞融合等生物工程技术的飞速发展
，发酵工业进入现代发酵工程的阶段。不但生产酒精类饮料 、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素
、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物 ，生产天然杀虫剂 、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料
，在化学工业上生产氨基酸
、香料、生物高分子 、酶
、维生素和单细胞蛋白等
。

从广义上讲，发酵工程由三部分组成：上游工程 ，发酵工程和下游工程。其中上游工程包括优良种株的选育
，最适发酵条件（pH、温度 、溶解氧和营养组成）的确定，营养物的准备等 。发酵工程主要指在最适发酵条件下 ，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术
。下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术。

发酵工程的步骤一般包括：

第一步，菌种的选育 。

第二步
，培养基的制备和灭菌
。

第三步，扩大培养和接种。

第四步 ，发酵过程 。

第五步
，分离提纯
。

发酵工程在医药工业
、食品工业、农业 、冶金工业
、环境保护等许多领域得到广泛应用。 酶工程是指利用酶、细胞或细胞器等具有的特异催化功能，借助生物反应装置和通过一定的工艺手段生产出人类所需要的产品 。它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术
。

酶工程 ，可以分为两部分。一部分是如何生产酶
，一部分是如何应用酶 。

酶的生产大致经历了四个发展阶段。最初从动物内脏中提取酶，随着酶工程的进展 ，人们利用大量培养微生物来获取酶
，基因基因工程诞生后，通过基因重组来改造产酶的微生物 ，近些年来
，酶工程又出现了一个新的热门课题，那就是人工合成新酶 ，也就是人工酶
。

酶在使用中也存在着一些缺点。如遇到高温 、强酸、强碱时就会失去活性，成本高
，价钱贵 。实际应用中酶只能使用一次等
。利用酶的固定化可以解决这些问题，它被称为是酶工程的中心。

60年代初 ，科学家发现
，许多酶经过固定化以后，活性丝毫未减 ，稳定性反而有了提高 。这一发现是酶的推广应用的转折点
，也是酶工程发展的转折点
。如今，酶的固定化技术日新月异。它表现在两方面：

一是固定的方法 。目前固定的方法有四大类：吸附法
、共价键合法、交联法和包埋法
。

二是被固定下来的酶 ，具有多种酶
，能催化一系列的反应。

与自然酶相比，固定化酶和固定化细胞具有明显的优点：

1.可以做成各种形状 ，如颗粒状 、管状
、膜状
，装在反应槽中，便于取出 ，便于连续、反复使用 。

2.稳定性提高，不易失去活性
，使用寿命延长
。

3.便于自动化操作，实现用电脑控制的连续生产。

如今已有数十个国家采用固定化酶和固定化细胞进行工业生产 ，产品包括酒精 、啤酒
、各种氨基酸、各种有机酸以及药品等等 。

关于“基因工程中如何将重组DNA整合到线粒体或叶绿体中的DNA上？
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